К методике определения цитокинетических показателей эритроцитарного баланса крови птиц

К методике определения цитокинетических показателей эритроцитарного баланса крови птиц

Е. А. Липунова, М. Ю. Скоркина

Белгородский государственный университет

Изложен оригинальный способ определения функциональной активности костного мозга (эритроцитарного баланса) у птиц в физиологических условиях, который может быть использован в качестве интегрального теста при оценке адаптационных резервов системы эритрона в условиях действия экстремальных факторов. Это позволяет использовать предлагаемый способ в гематологии и экологии животных. Способ технически прост, экономичен и отличается высокой воспроизводимостью.

Введение

В настоящее время разработаны надежные методы определения отдельных периодов и всего генерационного цикла клеток [1, 4, 6]. Особый интерес представляет количественная характеристика резерва эритроцитов, возможность его мобилизации при различных состояниях организма. Современная методика подсчета костномозговой продукции эритроцитов, разработанная Е. Н. Мосягиной [3, 4] и усовершенствованная А. В. Илюхиным и соавт. [1], основана на определении продолжительности жизни эритроцитов по содержанию ретикулоцитов до и после инкубации пробы крови за определенный промежуток времени, поскольку равновесие системы эритрона в норме обусловлено двумя факторами: естественной гибелью эритроцитов и их костномозговой продукцией [6].

Метод не получил широкого распространения ввиду недостаточной его проработанности, высокой вариабельности и не всегда физиологически обоснованных различий цифровых данных, отражающих концентрации ретикулоцитов, определяемых при разных способах их окраски. Кроме того, анализ литературных источников показал достаточно редкую применимость метода при исследовании активности эритропоэза у птиц и низших позвоночных и, как следствие, слабую изученность обозначенного вопроса у этих групп животных. Применение общепринятого способа оценки интенсивности эритропоэза у других систематических групп животных не представляется возможным ввиду физиологоморфологических и биохимических особенностей эритроидного ростка кроветворения, а именно – различной скорости созревания, высокого разновозрастного полиморфизма клеток в периферическом русле и сохранения ядер у зрелых форм.

В связи с этим задачей исследования явились усовершенствование способа выявления ретикулоцитов и их возрастной классификации для функциональной диагностики системы красной крови по данным подсчета инкубированных ретикулоцитов птиц в физиологических условиях.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служила кровь, полученная из подкрыльцовой вены у здоровых половозрелых петухов кросса “Иза Браун”. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% цитрат натрия, 0,1 мл которого смешивали с 0,4 мл крови. Кровь с антикоагулянтом инкубировали в течение 4 ч [2] в биологическом термостате при 39°С. По истечении времени инкубации в пробирку отбирали 0,3 мл крови и добавляли 0,1 мл 1% раствора бриллиантового крезилового синего, приготовленного на физиологическом растворе (0,9% NaCl), продолжительность окрашивания при комнатной температуре составила 40 мин. Затем на чистых обезжиренных стеклах готовили мазки, которые фиксировали в метаноле, высушивали на воздухе и микроскопировали под иммерсией. Подсчет ретикулоцитов производили по степени их зрелости на 1000 эритроцитов, используя анализатор изображений “Видео-Тест-Мастер-Морфология” с программным обеспечением [5]. Диагностику функционального состояния системы красной крови производили по показателям эритроцитарного баланса, которые рассчитывали по формулам, предложенным А. В. Илюхиным и соавт. [1].

Результаты исследования

Используя предлагаемый способ, в крови птиц выявлены ретикулоциты в виде вытянутых эллипсоидов, окрашенных в бледно-зеленый цвет с ядром от светло-синего до фиолетового цвета, и синей сеточкой, имеющей различную конфигурацию в клетках разной степени зрелости: ретикулоциты 1 класса – сеточка заполняет всю... цитоплазму и накладывается на ядро; ретикулоциты 2 класса – сеточка густо заполняет всю цитоплазму, при этом не накладывается на ядро; ретикулоциты 3 класса – сеточка расположена в основном вокруг ядра, иногда в виде эксцентрично лежащих клубков; ретикулоциты 4 класса – сеточка в виде нитевидных образований и отдельных включений, рассеянных по всей цитоплазме. Эритроциты – бледно-зеленого цвета с интенсивно синим ядром, без внутриклеточных включений (рис.).

Периферическая кровь петухов, увеличение х1600 1- ретикулоцит 1 класса, 2 – ретикулоцит 2 класса, 3 ретикулоцит – 3 класса.

Как видим, в условиях физиологической регенерации системы крови в связи с особенностью эритропоэза птиц, который при нормобластическом типе кроветворения предполагает поступление недозревших форм эритроцитов в периферическую кровь, где завершается процесс их формирования, присутствуют ретикулоциты третьего и четвертого классов. Причем ритм регенераторных процессов системы эритрона (интенсивность эритропоэза) у отдельной особи будет зависеть от лабильности и адаптационных возможностей нервных структур, а также функционального резерва костного мозга птицы. Результаты показателей эритрокинетики представлены в табл.

Показатели эритроцитарного баланса крови птиц в физиологических условиях

Птицы

^р,

Млн/мкл

Классы

Ретикулоцитов

, %

^0, %

Np4, %

Ту р, ч

Ту эр, сут

N, тыс/ (мкл-сут)

I – 0

3

5,2

II – 0

2,7

0,8

2,28

35,18

102433,2

III – 1,2

IV – 1,5

I – 0

7

4,96

II – 0

2,6

0,4

1,48

23,71

137080,1

III – 1,8

IV – 0,8

I – 0

9

5,55

II – 0,1

3,4

0,5

1,45

17,77

216440,6

III – 1,6

IV – 1,7

I – 0

10

3,7

II – 0

2

0,7

2,64

55

46620,0

III – 0,9

IV – 1,1

Примечание: N эр – количество эритроцитов в 1 мкл крови; Np0 – количество ретикулоцитов до инкубации; Np4 – количество ретикулоцитов после 4 ч инкубации; Т У p – период полувыведения ретикулоцитов из пробы, обусловленный их созреванием; Т У эр – период полувыведения эритроцитов из кровотока; N – продукция эритроцитов.

Заключение

Показатель функциональной активности эритроидного ростка кроветворения является одним из важных диагностических тестов, применяемый при оценке интенсивности процессов физиологической и репаративной регенерации в системе крови, может быть изучен у различных систематических групп животных с использованием менее атравматичного для клеток, точного метода, позволяющего получать достоверные результаты и экономить время исследования.

Список литературы

Илюхин А. В., Бурковская Т. Е., Шафиркин А. В., Ключанская Н. В. Некоторые методические вопросы исследования эритроцитарного баланса по данным подсчета инкубированных ретикулоцитов // Космическая биология и авиакосмическаямедицина.-1982.-Т.16, № 3. – С. 86-88.

Ляпунова Е. А., Скоркина М. Ю. Цитокинетические показатели эритроцитарного баланса у птиц в физиологических условиях // Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях. Сборник статей. – Томск: Изд-во ТГУ, 2001. – С. 31-33.

Мосягина Е. Н. Эритроцитарное равновесие в норме и патологии – М.: Медгиз, 1962. – 271 с.

Мосягина Е. Н., Владимировская Е. Б., Торубарова Н. А., Мызина Н. В. Кинетика форменных элементов крови. – М.: Медицина, 1976. – 270 с.

Патент на изобретение № 2227280 РФ. Способ определения ретикулоцитов в инкубированной крови птиц / М. Ю. Скоркина, Е. А. Липунова. – по заявке № 2002119253 от 16.07.02 // БИПМ. – № 11, Ч. – 2004. – С. 557.

Илюхин А. В., Шашков В. С., Бурковская Т. Е., Зубеннова Э. С. Цитокинетика и морфология кроветворения при хроническомоблучении.-М.:Энергоиздат,1982. – 136 с.


Зараз ви читаєте: К методике определения цитокинетических показателей эритроцитарного баланса крови птиц